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麻风杆菌耐药的分子学检测

2005-12-01 作者:刘沐桑摘译李文忠审校 浏览:5668

一.前言

    在世界许多地区,麻风联合化疗(MDT)对于减少麻风耐药的发生和降低麻风的患病率有效。不同的是,MDT对于减少麻风的发病率无效。建立如同MDT一样成功控制麻风的战略需要对治疗失败的教训进行全面评估,包括药敏试验。近来检测麻风杆菌药物敏感试验的“金标准”是繁杂耗时的鼠足垫试验。近几年来,快速检测耐药麻风杆菌的DNA技术已得到开发和应用。尽管该试验是基于现代分子生物学技术,但很多麻风流行国家的参照实验室已经有能力加以实施和应用,从而能够及时、有效地发现耐药菌株,有助于限制麻风耐药菌的传播。

二. 抗麻风药物及耐药机制

    在1950年代,氨苯砜是麻风化疗的标准药物。由于氨苯砜对麻风杆菌的缓慢的抑菌作用,因此需要长期(往往是终身)服用。在许多地区,长期单用胺苯砜治疗导致患者的依从性差,最终引起治疗失败和在1970年代发生了麻风耐胺苯砜菌株。在1960~1970年代,利福平和氯法齐明等药物用于麻风的治疗。尽管利福平是一种较强的抗麻风药物,利福平单用或与氨苯砜联合治疗耐氨苯砜麻风菌株同样会导致利福平耐药菌的迅速发生。此外,氯法齐明对麻风杆菌仅有弱的杀菌作用,不适于作为麻风的单疗药物。

    为了消除全球氨苯砜耐药传播的威胁和提高疗效,WHO于1981年推荐了麻风MDT。MDT对于多菌型和少菌型麻风都是非常有效和成功的,全球麻风的总患病率已经明显下降。最近,氧氟沙星和米诺环素亦已用于治疗麻风。然而,即使用这些强效的药物进行联合治疗,仍然可以出现耐药现象。

1.    氨苯砜

    氨苯砜是合成的砜类药物,结构和功能与磺胺药物类似,作用于二氢叶酸合酶(DHPS)。氨苯砜作为对氨基苯甲酸(PABA)的一种竞争性抑制剂,抑制细菌的叶酸合成。由folP编码的高度保守的大肠埃希氏菌DHPS的PABA结合位点的特异性突变导致了氨苯砜耐药的发生。氨苯砜还作用于麻风杆菌的叶酸合成途径。麻风杆菌基因序列研究发现,麻风杆菌有2组folP的同源染色体(folP1和folP2)。folP1似乎是含有3个其它基因的操纵子的一部分,与叶酸合成有关,这一方面与结核杆菌类似。一般认为,在folP1的砜类耐药决定区(SRDR)密码子53和55的错义突变导致麻风杆菌氨苯砜高度耐药的发生(表1)。

1. 与麻风杆菌耐药有关的药物靶位基因的突变

药物/靶位基因

药物敏感性*

突变

分离株数(%)**

利福平/rpoB

R

Gly401Ser; His420Asp

1(2)

 

R

Gln407Val

1(2)

 

R

Phe408/Met409; LysPhe insert

1(2)

 

NC

Asp410Asn

1(2)

 

NC

Asp410Asn; Leu427Pro

1(2)

 

R

Ser416Cys

1(2)

 

R

His420Asp

1(2)

 

R

His420Tyr

11(20)

 

R

Ser425Leu

33(60)

 

R

Ser425Met

1(2)

 

R

Ser425Met; Leu427Val

1(2)

 

R

Ser425Phe

1(2)

 

NC

Ser425Trp

1(2)

氨苯砜/folP1

R

Thr53Ala

12(40)

 

NC

Thr53Ala,Pro55Leu

1(3)

 

R

Thr53Arg

2(7)

 

R

Thr53Ile

4(13)

 

R

Pro 55Arg

3(10)

 

R

Pro55Leu

8(27)

氧氟沙星/gyrA

NC

Gly89Cys

1(14)

 

R

Ala91Val

6(86)

 

*R=通过鼠足垫或放射性呼吸药物敏感性测定所确定的耐药表型。NC=尚未得到其中任一方法的证实。

**%(四舍五入后结果)在各个耐药组中,存在特定的突变分离株的构成比。

 
2.    利福平

    利福平是所有推荐的抗麻风化疗方案中的关键的杀菌性药物。利福平在分枝杆菌和大肠埃希氏菌的靶位是由rpoB编码的RNA聚合酶的β亚基。由于rpoB高度保守区域密码子的错义突变(利福平耐药决定区,RRDR),依赖DNA的RNA聚合酶的β亚基结构改变,引起分枝杆菌对利福平耐药。利福平对麻风杆菌耐药也与rpoB的RRDR的错位突变有关。与麻风杆菌利福平耐药发生相关的最常见的突变是密码子Ser425的置换(表1)。

3.    氧氟沙星

    氧氟沙星被证实具有中度抗麻风作用,其作用机制不明。在其它细菌中其似乎通过抑制DNA促旋酶(II型DNA拓扑异构酶),从而抑制DNA复制。在大多数分枝杆菌的耐药菌株中,gyrA的一段高度保守序列(耐喹诺酮类决定区,QRDR)的突变与氧氟沙星耐药的发生有关。麻风杆菌gyrA的QRDR与结核杆菌有高度同源性,在耐氧氟沙星麻风菌株中已发现该区域的错位突变(表1)。 

4.    氯法齐明

    氯法齐明抗分枝杆菌的作用机制尚未阐明。氯法齐明抗麻风作用的最重要的优点是单一核巨噬细胞细胞内药物浓度高、有抗炎活性、耐药的发生率低和代谢清除缓慢。它具有高度亲脂性,易与分枝杆菌DNA结合。目前仅有数例耐氯法齐明麻风病例报告。

5.    米诺环素

    米诺环素是四环素族抗生素中唯一被证实对麻风杆菌有显著活性的药物,也许是由于其亲脂性特点。米诺环素对麻风杆菌有杀菌作用,与氨苯砜和利福平联合应用有附加作用。该药对麻风杆菌的作用机制不明,但认为与现有四环素族药物类似,通过抑制蛋白合成而发挥作用。麻风杆菌对米诺环素耐药的分子生物学机制尚未进行研究,主要因为该药仅在近来才用于治疗单一皮损的PB麻风患者,而且尚未发现耐药菌株。

三.    麻风杆菌耐药的发生

    麻风杆菌对大多数抗麻风药物发生耐药的机制尚缺乏直接证据,现在的认识是基于对结核杆菌、其它细菌的研究,以及对麻风杆菌基因在替代宿主中进行的少量研究。这些研究预示:1) 麻风杆菌耐药源于编码药物靶点基因的染色体突变;2)这些突变是自然发生的,系由于DNA错误复制的结果;3)由于药物治疗不当或不足,使得这些突变进一步增加。

    因为麻风杆菌尚不能在体外培养,在一菌群中耐药突变的频率主要根据对结核杆菌的研究推断。比如在一麻风菌群中氨苯砜耐药突变的频率估计为10-6,利福平和氧氟沙星耐药的频率估计为10-7和10-8,氯法齐明耐药的频率尚不知道,但似乎相当低。由于未治疗过的MB病人含有大量细菌(>1011条麻风菌),因此,一个患者可能含达105条氨苯砜耐药菌和数千条利福平或氧氟沙星耐药菌。如果这些患者治疗不当(依从性差或治疗不足),就有可能潜在大量麻风杆菌耐药亚群,从而导致一种或多种耐药表型的传播。实际上,世界上很多地区已经发现了麻风耐药菌株。

四.    麻风耐药的检测

    麻风杆菌的传统的药敏试验是依赖于小鼠足垫的麻风杆菌接种。需6个月到1年后才能获得结果。因为需要一定量的细菌,只有含中至大量菌荷的患者才能作该试验。放射呼吸测定法(BACTEC)作为对麻风杆菌的第一个快速药物筛选的方法,已经成功地用于鉴定新抗麻风药物。虽然该技术已广泛用于药物筛选,但其用于麻风药敏试验时,必须从每位患者取得大量活菌(≥107),而受到限制。

    在全球的不同地区麻风耐药的连续报告中,监测耐药的分子学方法简化了药敏试验,为全球的耐药监测提供了新的手段。为了减少所需的菌量和尽可能缩短麻风杆菌药敏试验的时间,数种基于鉴定耐药突变基因型的试验方法已得到开发。

1. PCR产物的直接DNA测序法

    耐药的直接DNA测序法是所有以核酸为基础的突变检测方法中最权威性的方法,因为它检测靶基因中与耐药抗生素有关突变的真实核苷酸变化。此外,该方法可以设计成种属特异性的,为被检测标本中的特定病原体的出现提供直接证据。PCR产物的直接DNA测序法曾经被用于鉴定麻风杆菌的利福平、氨苯砜和氧氟沙星耐药。这些试验使用针对麻风杆菌的RRDR,SRDR和QRDR的寡核苷酸引物,采用 PCR法扩增皮肤活检标本中的适当的靶DNA。通过带有双脱氧DNA序列的探针与这些区域自动或手动结合,来获得这些PCR产物的DNA序列。然后对该DNA序列检测是否出现与先前麻风杆菌耐药有关的突变。PCR产物的直接DNA测序法可以在装备自动或手动DNA测序系统的诊断实验室内开展,需要大约1~2天即可获得临床标本的药敏结果。

2. PCR-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)

    Hornore等改良了PCR-SSCP用于检测人类标本中的耐利福平麻风杆菌。为了达到这一目的,使用了PCR扩增RRDR靶基因。这些双链PCR产物被加热解离成单链,通过严格控制温度条件的变性凝胶电泳分离。然后给凝胶染色,观察SSCP图谱的DNA片段迁移率带谱。SSCP中观测的DNA片段带谱可高度复写,而且可以产生针对特定突变的迁移率。

3. PCR-异源双链分析法(PCR-DHA)

    PCR-DHA检测细菌耐药最初使用通用异源双链生成物(UHG),检测结核杆菌耐药。类似方法被改良成PCR-UHG法,用于检测瘤型麻风患者皮肤活检组织匀浆中的耐氨苯砜麻风杆菌。该法需要对folP1的SRDR进行PCR扩增,再用通用异源双链生成物(UHG-DDS-141)与这些PCR产物反应。UHG-DDS-141是合成的141bp SRDR DNA片段, 含有多个错配的碱基,与folP1 53和55号密码子结合(这些密码子发生的随机突变与氨苯砜耐药有关)。当UHG-DDS-141在加热变性和逐渐成为麻风杆菌变性的SRDR PCR产物时,通过标准异源双链核酸分子,独特结构来源的异源双链在电泳分析时提供了放大的突变检测。PCR-UHG完成大约需要6小时,使用6%预制的非变性的氨基丁三醇-硼酸-EDTA迷你胶和非放射性的检测模式。

4. PCR-固相反向杂交分析法

    PCR-固相反向杂交分析法检测麻风杆菌利福平耐药与线性探针检测法(LiPA)检测结核杆菌利福平耐药类似。PCR初始步骤是采用生物素化的未标记探针,产生一个83bp的麻风杆菌RRDR生物素化的片段。然后,扩增的PCR产物与一系列的DNA包被探针杂交(这些探针事先被固定在Biodyne C尼龙膜的特定位置)。被固定的包被探针是麻风杆菌利福平敏感株或特定的突变株ropB RRDR小片段同源的小DNA片段。杂交反应在设计中严格要求PCR产物只能与具有100%同源序列的探针结合。终杂交物用抗生物素蛋白链菌素偶联过氧化物酶的化学发光剂检测。被检测菌的基因型最终由包被探针产生的杂交信号决定。

五.    展望

    DNA的分析是直接从临床标本检测到麻风杆菌的基因突变。然而,遗憾的是并非所有导致麻风杆菌耐药的突变现象都可以被识别到,在不同药物靶基因发现的各种突变也尚未全部被证实。此外,限制我们对耐药机制认识的主要原因之一是目前尚无法在无菌培养基上体外培养麻风杆菌,以及通过基因研究验证突变和耐药的关系。因此,为了增加对麻风杆菌耐药机制的认识,以及借助于分子生物学先进技术开展目标基因的鉴定,有待于开展更加广泛和深入的研究。

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